3) часу росту первинної смужки досліджуваної культури. Найкращий термін інкубації 48 годин, але якщо в екстрених випадках він скорочується до 24 годин, зона пригнічення росту може бути виражена в межах 1,5-, що при відсутності належного досвіду ускладнить облік результатів. Збільшення інкубації понад 48 годин також небажано, тому що може в зв'язку з виснаженням середовища і зміною вологості з'явитися неспецифічне пригнічення росту більшості індикаторних культур. У тих випадках, коли по яких-небудь технічних причинах через 48 годин інкубації досліджуваної культури дослід не може бути продовжений, потрібно як звичайно простерилізувати чашки парами хлороформу, а потім поставити їх у холодильник. Зберігати такі чашки до нанесення індикаторних штамів без збитку для типування можна 2-3 доби;

4) зниження спектру чутливості окремих індикаторних культур. Необхідно проводити контроль стабільності індикаторних культур не рідше одного разу на місяць, або, принаймні, після кожного пересіву із середовища Дорсе на середовище Дорсе. Використовувати бульйонні культури тільки для типування і однократно (тобто не можна залишати на 1-2 дня для наступних дослідів). Для типування пересівати культури тільки із середовища Дорсе.

Облік результатів проводять відповідно схеми, що додається (таблиця 2). У випадках, коли встановлений тип не співпадає з одним із відомих типів, культуру розсівають на середовищі Ендо (перевіряють на чистоту) і типують декілька ізольованих колоній, а також перевіряють на стабільність індикаторні штами. При отриманні після цього аналогічних результатів з субкультурами досліджуваного штаму, такі культури позначають як ті, що не типуються. У зв’язку з можливостю знаходження нових коліциногено-типів, такі культури необхідно пересилати до обласних СЕС та Центральної СЕС МОЗ України у встановленому порядку.

При достатньому досвіді і хороших технічних навичках можна проводити посіви 2-х смужок досліджуваних культур на одну чашку на відстані між ними біля . Індикаторні культури наносять паралельно штрихами між досліджуваними (мал. 3). Облік проводять за звичайною схемою.

Форма реєстрації результатів у робочому журналі наведена нижче (таблиця 3).

Визначення типу коліцина, що продукується, за методом Аббота і Шеннона дозволяє протипуватии до 90-95% штамів S.sonnei. Серед інших видів збудників дизентерії феномен коліциногенії зустрічається набагато рідше, наприклад, S.flexneri коліциногенні: підвид Флекснера 0,5 –1,0%; підвид Ньюкасл 20,0 – 25,0%; підвид Бойда 40,0 –50,0%.

Таблиця 3

Форма робочого журналу для реєстрації визначення коліціногенної активності S.sonnei

№№ досліджуваних культур

Індикаторні штами

Тип

31

32

33

36

38

39

8218

40

43

44

18

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

7

271

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

11

350

+

-

+

-

+

-

-

-

-

+

8

367

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

0

У зв'язку з цим особливого значення набуває метод визначення чутливості досліджуваних неколіциногених культур до визначених коліцинів, що продукуються еталонними культурами з колекції Фредеріка, тобто колицинотипування.

Чутливість шигел до коліцинів специфічна і залежить від наявності на поверхні бактеріальної клітки рецепторів для фіксації коліцинів. Окремим коліцинам або групі їх (наприклад, коліцинам групи Е) відповідають визначені рецептори. Крім того, на чутливість бактерій впливають стійкість до коліцинів і імунітет до дії коліцина, ідентичного тому, що продукується самою клітиною. Коліциночутливість визначається в 90-95% шигел незалежно від видової приналежності, але ця ознака не є такою стабільною, як здатність продукувати коліцини. Зміна спектра коліциночутливості частіше відмічається серед культур, схильних до дисоціації (S.sonnei). У зв'язку з цим необхідно типувати свіжовиділені культури, не залишаючи їх на тривале зберігання.

Культури з вогнища досліджуються одночасно. Визначення чутливості проводиться на 15 еталонних культурах, що продукують визначені коліцини (таблиця 4).

Таблиця 4

Паспортні дані еталонних коліциногенних штамів з колекції Фредеріка

№№ з/п

Назва штаму

Тип коліцина, що продукується

E.coli

Са-7

V+m

Е.coli

Са-18

B

E.coli

Са-23

D

Е.freundi

Са-31

A

E.coli

Са-38

E+1

E.coli

Са-42

F

E.coli

Са-53

I

E.coli

Са-58

H

E.coli

Са-62

J+I

E.coli

К-235

K

S.boudii

Р1

S1

S.sonnei

Р9

S3+1

S.dispar

Р14

S5

S.dispar

Р15*

S4

E.coli

Са-46

G

* Культури S.dispar P15 на поживних середовищах при зберіганні утворюють пігмент жовтого кольору, інтенсивність якого збільшується до яскраво-апельсинового кольору

При одержанні колекції еталонних культур Фредеріка необхідно раз 5-6 пропасирувати їх через звичайний МПБ. Після чого визначити біохімічну характеристику і біологічну (гальмівну) дію на універсальних коліциночутливих індикаторних культурах – Е.coli K-12 ROW (її субкультурою є індикатор Аббота і Шеннона), Е.coli φ і Е.coli B.

Чутливість цих індикаторних культур приведена в таблиці 5. Перевірку еталонних Е.coli проводять не рідше 1 рази в 2-3 місяця.

Таблиця 5

Паспортні дані індикаторних культур з колекції Фредеріка

№№ з/п

Назва штаму

Примітка

E.coli К-12, ROW

Чутливий до всіх коліцинів колекції Фредеріка

Е.coli φ

Не чутливий до S1 і S4

Е.coli B

Не чутливий до коліцинів F,S1 і S5

Коліцинотипування, як і коліциногенотипування, засновано на використанні феномена відстроченого антагонізму, що виявляється методом перехресних посівів, який описаний у розділі “коліциногенотипування” з тією тільки різницею, що спочатку смужкою наносять відому еталонну коліциногенну культуру, а через 48 годин паралельними штрихами перпендикулярно еталонній підсівають 18-годинні бульйонні досліджувані культури, або методом агарових шарів, опис якого наведений нижче.

Перший день

Еталонні культури з колекції Фредеріка пересівають на м’ясо-пептонний бульйон і поміщають у термостат на 18 – 20 годин при (37±1) ºС.

Агар Хоттингера з генціанвіолетом, як зазначено вище в розділі “коліциногенотипування”, розливають у чашки Петрі, кількість яких перевищує число досліджуваних культур у два рази.

Другий день

Маркують чашки з агаром для посіву еталонних культур. На першій чашці для 8 культур, на 2-ій – для 7 культур. Підписують на кожній чашці тільки одну культуру, від якої стрілкою вказують напрямок і порядок посіву, по периметру чашки ставлять крапки, що відповідають кількості і місцю посіву наступних культур (мал.4).

1) Са – 7, Са 18, також Са 23, Са 31, Са 38, Са 42, Са 46, Са 53.

2) Са 58, Са 62, К- 2351, Р1, Р9, Р14, Р15. Наносити всі 15 культур на одну чашку не рекомендується, тому що S.sonnei мають множинну чутливість до коліцинів і облік результатів досліду буде ускладнений. Еталонні 18-годинні бульйонні культури наносять уколом в агар відповідно маркуванню чашки, і посіви інкубують при (37±1) ºС 48 годин.

Третій день

Досліджувані культури засівають у м’ясо-пептонний бульйон і витримують при (37±1) ºС протягом 18 – 20 годин.

Четвертий день

Чашки з посівами еталонних культур, що виросли у вигляді макроколоній – бляшок, виймають з термостата. Посіви обробляють за звичайною методикою 1–1,5 години у парах хлороформу. До розплавленого й охолодженого до 45ºС 0,2% агару (по 5-6 см3 у пробірці) додають 4-5 краплі бульйонної досліджуваної культури і виливають по 2,5-3 см3 у кожну з 2-х чашок з макроколоніями еталонних культур. Чашки інкубують 18 – 20 годин при (37±1) ºС.

П'ятий день

Облік результатів типування проводять по зонах пригнічення росту досліджуваних культур. Навколо макроколоній (мал. 5) розмір зони визначають міліметрівкою від краю колонії до початку росту досліджуваної культури. Зони, розмір яких менш 1,5 – не враховують, тому що при повторних типуваннях досліджуваної культури чутливість до даного коліцину може бути цілком відсутня. Затримку росту відзначають плюсами: зона 2- ++, зона 5- +++, зона понад ++++.

Результати типування заносять у реєстраційний журнал у вигляді спектра чутливості до еталонних коліцинів (таблиця 6).

Таблиця 6

Схема реєстрації результатів коліцинотипування культур у робочому журналі

№№ культур

Назва культур

Чутливість

112

S.sonnei

B, D, F, S5

418

S.sonnei

B, F, Е +J, К

Додаток13

Рецептура деяких поживних середовищ і спосіб їх приготування

1. Загальні вимоги

1.1. Загальні вимоги до приготування поживних середовищ (ПС) згідно ГОСТ 10444.1-84. “Консервы. Приготовление растворов, реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе”

1.2. Контроль якості ПС здійснюють згідно ІЛ ЦСЕС МОЗ України №05.4.1/1670 від 15.11.2000 року “Бактеріологічний контроль поживних середовищ”.

1.3. Кожне приготування ПС і результати контролю якості реєструють в журналі за ф. 256/О “Журнал приготування та контролю поживних середовищ”.

2. Консерванти

Гліцеринова суміш:

Склад:

Натрію хлорид (NaCl) 0,85% розчин

Гліцерин нейтральний

Натрію гідрофосфат безводний (Na2HPO4) 20% розчин

– 1000 см3

– 500 см3

– 150 см3

Приготування: змішують перших два інгредієнти і додають розчин натрію гідрофосфата у такій кількості, щоб довести рН до 7,8 – 8,0, розливають у пробірки або флакони по 10 см3, стерилізують в автоклаві при (112??1) ºС протягом 15 хв. або текучою парою 3 дні підряд. Після стерилізації рН 7,8 – 7,8.

Фосфатно-буферна суміш:

Склад:

Калію дигідрофосфат (KH2PO4)

Натрію гідрофосфат безводний (Na2HPO4)

Вода дистильована

– 1000 см3

Приготування: Інгредієнти змішують, розливають по 10 см3 в пробірки або флакони, стерилізують в автоклаві при (120??1) ºС 30 хв.

Буферна гліцерино-сольова суміш:

Склад:

Натрію хлорид (NaCl)

Калію гідрофосфат (KHPO4)

Калію дигідрофосфат (KH2PO4)

Гліцерин нейтральний

Вода дистильована

– 300 см3

– 700 см3

Приготування: інгредієнти розчиняють, перемішують, суміш розливають в стерильні пробірки по 5 см3, автоклавують при (112??1) ºС 30 хв. Рекомендують з метою кращого перегляду розчин слабко підфарбовувати феноловим червоним.

Розчини для приготування розведень

0,1% пептонна вода:

Склад:

Натрію хлорид (NaCl)

Пептон

Вода дистильована

– 1000 см3

Приготування: натрію хлорид та пептон розчиняють у дистильованій воді при повільному нагріванні. Отриманий розчин, при необхідності, фільтрують через паперовий фільтр, встановлюють рН 7,0 ??0,1, розливають в колби, пробірки або інший посуд, закривають і стерилізують при (121??1) ºС протягом 30 хв.

Середовища збагачення та для первинного посіву

Сухі середовища Плоскірева, Ендо, вісмут-сульфіт агар, Олькеніцкого, Кліглера, селенітовий бульйон Лейфсона, магнієве середовище промислового виготовлення готують за прописом, зазначеним на етикетці.

Середовище Раппопорт

Склад:

М’ясо-пептонний бульйон

– 900 cм3

Стерильна бичача жовч

– 100 cм3

Глюкоза

Розчин індикатора Андреде

– 10 cм3