Страница 21: Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція (45104)

Додаток 12

Методи визначення коліціногенної активності та коліціноварів шигел

Визначення коліціногенної активності основане на властивості шигел продукувати коліціни з неоднаковим спектром дії на чутливі до них бактерії. За його допомогою можуть бути диференційовані багато штамів шигел, що мають здатність продукувати коліціни (коліціногенність)

Чутливість до коліцинів залежить від наявності на поверхні бактеріальної клітки рецепторів, на яких відбувається адсорбція коліцинів; властивість ця специфічна, тому що адсорбція різних коліцинів відбувається на визначених рецепторах. В залежності від спектра дії на чутливі бактерії і фізико-хімічні властивості усі відомі в даний час коліцини розділені на 24 типи: А; В1; В2; С; Д; Е1; Е2; Е3; Е4; G; H; І; К; L; М; N; О; Р; Х; V1; VІ;V2; V3; V4; V5.

Підрозділ бактерій за коліциногенними властивостями зветься “коліциногенотипування” і виявляється методом відстроченого антагонізму за допомогою спеціально підібраних індикаторних культур. У процесі росту коліциногенного штаму коліцин дифундує в поживне середовище, де може бути виявлений за допомогою індикаторних культур, чутливих або стійких до визначених коліцинів.

Далі приводиться два методи типування шигел на основі феномена коліциногенії:

1. Модифікований метод визначення коліціногенної активності S.sonnei за Абботом і Шенноном;

2. Визначення коліциноварів по чутливості до коліцинів за методом Фредеріка (типування неколіциногенних варіантів S.sonnei та інших видів шигел).

Метод коліциногенотипування S.sonnei за Абботом і Шенноном заснований на визначенні за допомогою індикаторних культур типу коліцина, що продукується досліджуваними штамами S.sonnei. Набір індикаторних культур складається з 15 штамів; з яких –13 S.sonnei , 1-S. disenteriae 2 і 1- варіант Е.coli.К-12 ROW.

Для практичного використання оригінальний метод був дещо модифікований. Зокрема, рекомендовано брати меншу кількість індикаторних штамів. В цій модифікації метод, прийнятий як офіційно діючий і передбачає постійне використання 10 штамів, що включають 8 штамів S.sonnei, один – S.dysenteriae 2 та один E.coli. За їх допомогою може бути встановлено 17 коліциногеноварів. Інші 5 індикаторних штамів (S.sonnei) використовують для уточнення характеристик, якщо результати визначення коліциногеновару за основною схемою викликають сумніви або необхідно їх підтвердити.

Типи стабільні як in vivo (у вогнищі або при повторному висіві від одного хворого висівається 1 тип), так і in vitro при збереженні в лабораторних умовах на середовищі Дорсе терміном до 2-х років і більше.

Для періодичної перевірки стабільності індикаторних культур у набір входять 15 еталонних культур, що належать до певних умовних коліциногенотипів (таблиця 1). Скорочена схема типування по коліциногенності представлена в таблиці 2.

Таблиця 1

Еталонні типові коліциногенні штами

Індикаторні і еталонні культури зберігають на середовищі Дорсе при кімнатній температурі під гумовими пробками для запобігання висихання середовища. Пересів еталонних культур проводять через 3-4 місяця, а індикаторних через 30-35 днів із середовища Дорсе на середовище Дорсе без пасажів на рідких середовищах.

Таблиця 2

Схема визначення коліціногенної активності S.sonnei за J.Abbot R. Shamon

(в модифікації М.А.Смирнової-Мутушевої, 1968)

Умовні позначення:

+ – гальмування росту індикаторного штаму;

- – відсутність зони гальмування росту індикаторного штаму;

Х– варіабельні результати

* Позначення індикаторних штамів відповідають наступним назвам оригінальних штамів: 31 – S.sonnei 2, 32 – S.sonnei 56, 33 – S.sonnei , 17, 37 – S.sonnei 56/98, 39 – S.sonnei R6, 8218 – S.dysenteriae 2 M19, 41 – S.sonnei 2/64, 42 – S.sonnei 2/15, 43 – S.sonnei R5, 44 – E.coli k-12 ROW, 34 – S.sonnei 2M, 35 – S.sonnei 38, 36 – S.sonnei 56/56, 38 – S.sonnei R1, 40 – S.sonnei 2/7.

Для коліциногенотипування використовують 1,5% поживний агар на гідролізаті Хоттінгера, що містить 130 – 150 мг % амінного азоту і рН-7,4. Агар Хоттінгера готують невеликими партіями в щільно закупорених флаконах (запобігання від висихання і зміни щільності агару).

Напередодні постановки досліду агар у флаконах розтоплюють на водяній бані, додаючи на 100 см3 середовища 2 – 4 краплі 0,1% спиртового розчину генціанвіолета для пригнічення росту сапрофітної повітряної флори та стимуляції коліцинопродукції, розливають по 20 см3 у чашки Петрі. У день досліду чашки із середовищем злегка (20-30 хвилин) підсушують у термостаті при температурі (37??1) ºС.

Коліциногенотипування проводять методом перехресних посівів.

Перший день (підготовчий)

Готують чашки Петрі з поживним агаром у кількості, рівній досліджуваним культурам. Досліджувані культури засівають у пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном і інкубують при (37??1) ºС 18 – 20 годин.

Другий день

На підсушені чашки наносять бактеріологічною петлею 18-годинні бульйонні культури штрихом по діаметру (по одній культурі на чашку) – (мал. 1). Посіви інкубують при (37±1) ºС протягом 48 годин.

Третій день

Індикаторні культури з середовища Дорсе пересівають на м’ясо-пептонний бульйон і поміщають в термостат (37±1) ºС на 18 – 20 годин.

Четвертий день

48-годинні досліджувані культури, що виросли на чашках з агаром у вигляді штриха, обробляють у парах хлороформу, для чого в кришку перекинутої догори дном чашки наливають близько 0,5 см3 хлороформу, закривають чашки і залишають при кімнатній температурі на 50-60 хвилин. Якщо по закінченню цього терміну на кришці залишаються сліди хлороформу, чашки відкривають і провітрюють 20-30 хвилин.

Індикаторні бульйонні культури наносять перпендикулярно первинному штриху, не торкаючись його, по 5 індикаторних культур з кожної сторони або всі 10 з однієї (мал. 2).

Індикаторні культури засівають у суворій послідовності і нумерують тільки перший індикаторний штам. Після посіву чашки інкубують при (37±1) ºС ще протягом 18-20 годин.

П'ятий день

Проводять облік результатів. Якщо досліджувана культура не коліциногенна, ріст всіх індикаторних культур буде неперервним по всій довжині.

Якщо випробовувані культури коліциногенні, то спостерігається гальмування росту чутливих до коліцину, що продукується, індикаторних культур. Як правило, ріст індикаторних штамів переривається за 3- до штриха досліджуваної культури. Величина зони інгібіції (гальмування) залежить від наступних причин:

1) концентрації коліцина в агарі. Тривале зберігання культур на простих середовищах тимчасово пригнічує продукцію коліцина;

2) швидкості дифузії у щільне поживне середовище. Швидкість дифузії залежить як від типу коліцина, так і від щільності поживного агару (не зберігати готові середовища у флаконах більш 2-х тижнів і завжди користуватися середовищем з однією і тією ж концентрацією);