C.рerfringens викликає зброджування лакмусового молока, що супроводжується просвітлінням сироватки й утворенням згустку цегляно-червоного кольору. Ферментують з утворенням кислоти і газу глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, галактозу. Не зброджують маніт і дульцит. У тканинах людини і тварин, а також на штучних поживних середовищах C.рerfringens типів А, В, С, D, Е можуть продукувати летальні, некротичні і гемолітичні токсини, що нейтралізуються типовими, специфічними, антитоксичними сироватками.
C.рerfringens типів D і Е виробляють протоксини (подібно C.вotulinum типів С, Е і F), здатні переходити в активні токсини під впливом протеолітичних ферментів. Бактерії виду C.рerfringens (особливо типу А) широко поширені в довкіллі (ґрунт, вода, харчові продукти і т.д.), присутні у вмісті кишечнику людей і тварин.
Харчові отруєння частіше мають місце після вживання готових м'ясних блюд, а також продуктів рослинного походження, що виявляються значно забрудненими клітками C.рerfringens типу А в результаті порушення правил готування і збереження їжі.
19.2. Бактеріологічні дослідження
У харчових продуктах і матеріалі від хворого (крім крові) визначають:
Перший день
З підготовлених до дослідження матеріалів (харчові продукти, блювотні маси, випорожнення й ін.) готують розведення на 0,1% пептонній воді до 10-10.
По 1 см3 матеріалу з відповідних розведень переносять у розплавлене й охолоджене до 45 ºС середовище Вильсона – Блер, розлите по 8 – 9 см3 у пробірки. Можна також використовувати кров'яний або жовтковий агари в чашках. Для цього 1 см3 кожного розведення додають у 15 см3 охолодженого до 45 ºС агару, ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі. Після застигання суміші заливають додатково стерильним, охолодженим до 45 ºС 2% м’ясо-пептонним агаром, шаром не менш . Інкубують 6 – 8 годин у термостаті при 45 – 46 ºС або 20 годин при (37±1) ºС.
Крім того, гомогенати досліджуваних матеріалів засівають в об’ємі 10 – 15 см3 на кожне з рідких середовищ, розлитих по 70 см3 у флакони??.
Кожен зразок матеріалу (крім крові) вносять у 2 флакони однакового середовища, один флакон з посівом прогрівають при 80 ºС 20 хвилин, а інший – не прогрівають, потім обидва флакони інкубують при (37±1) ºС. В умовах прогрівання звичайно гине стороння мікрофлора і частина анаеробів, що знаходяться у вегетативній формі. Зберігаються спори C.рerfringens, що у цих умовах активно проростають. У вирослих культурах із прогрітих посівів у ряді випадків може знаходитися тільки C.рerfringens, тобто чиста культура цих бактерій. Кров, у випадку бактеріємії, узята стерильно, буде містити тільки вегетативні клітки C.рerfringens. Тому посів крові проводиться без прогрівання.
Інтенсивне газоутворення, що свідчить про активний ріст культури, може спостерігатися через 3 – 6 годин після посіву матеріалу, доставленого не пізніше доби. У цьому випадку варто проводити бактеріологічні і токсикологічні аналізи в перший день дослідження. При відсутності активного росту через 6 – 8 годин, посіви інкубують при (37±1) ºС протягом 18 – 20 годин.
Другий день
У посівах на середовищі Вильсона – Блер роблять підрахунок чорних колоній, де мається від 10 до 30 колоній, або на чашках, де міститься від 20 до 100 колоній із зоною гемолізу, або з зоною опалесценції. Множать кількість колоній на розведення матеріалу в цій пробірці, або чашці Петрі. Так, якщо в 6 пробірці або чашці міститься 30 характерних колоній, контамінації одного грама або одного см3 вихідного матеріалу буде складати 30??106. Роблять мазки з 3 – 5 характерних колоній, фарбують фарбою для анаеробів або за Грамом. Крім того, 2 – 4 колонії пересівають на лакмусове молоко і 3 – 5 колоній – на будь-які з м'ясних середовищ у пробірках для одержання чистої культури.
Визначення токсинів варто проводити через 3 – 6 годин після посіву матеріалу на рідкі середовища з появою ознак початку росту культури (див. перший день дослідження) або на другу добу, якщо посівний матеріал виростає тільки через 18 – 20 годин інкубації. З культур на рідких середовищах, де відзначений ріст із газоутворенням, готують мазки, фарбують їх за Грамом або фарбою для анаеробів. Ті посіви, у яких виявляють грампозитивні палички, схожі по морфології на C.рerfringens, перевіряють на присутність специфічних токсинів C.рerfringens типу А, В, С, D, Е Методом реакції нейтралізації з діагностичними сироватками C.рerfringens типів А, В, D, Е на білих мишах вагою 16 – ??.
Сухі протиперфрингенс сироватки перед уживанням розводять 1 см3 дистильованої води. При легкому струшуванні сироватка цілком розчиняється. Потім сироватки А, В, D, Е розводять у 10 разів фізіологічним розчином і в розведеному виді застосовують для постановки РН.
Постановка реакції нейтралізації
З флаконів у стерильних умовах відбирають по 8 – 10 см3 культуральної рідини. Культуру, що залишилася, у флаконах зберігають при температурі (6±2) ºС до закінчення дослідження. Після центрифугування при 3000 – 5000 об/хв. протягом 30 хв. у надосадовій рідині повинні знаходитися токсини C.рerfringens.
Спочатку ставлять РН токсину в досліджуваній рідині із сироваткою C.рerfringens типу А. Для цього в 2 пробірки вносять по 1,5 см3 надосадової рідини. Потім у 1 пробірку додають 0,75 см3 антитоксичної сироватки типу А, у 2-у контрольну – 0,75 см3 фізіологічного розчину. Суміш витримують 30 хвилин при 37 ºС, потім уводять по 0,75 см3 у хвостову вену 2-ом білим мишам вагою 16 – . Спочатку вводять суміш з контрольної пробірки, потім тим же шприцом – суміш з досвідченої пробірки. Реакцію враховують через добу.
Третій день
1. Переглядають пробірки з посівами на лакмусовому молоці. Поява характерного зброджування з просвітлінням сироватки й утворенням згустку цегельного кольору є додатковим підтвердженням того, що колонії чорного кольору, а також колонії з зонами гемолізу і преципітату на щільних середовищах, що визначають контамінацію досліджуваного матеріалу, відносяться до C.рerfringens. Враховують результати РН. Якщо контрольні миші упали, а ті, що отримали суміш токсину із сироваткою типу А – живі, варто дати висновок, що в досліджуваному матеріалі виявлений C.рerfringens типу А, активністю не менш 3 Dlm/см3 (для білої миші) і закінчити дослідження.
У тому випадку, якщо контрольні миші і що отримали суміш токсину із сироваткою типу А упали, варто ставити розгорнуту РН із сироватками C.рerfringens типів В, D, Е. Для виявлення штамів типів D і Е варто проводити активацію протеолітичними ферментами неактивних протоксинів, що продукують штами типів D і Е. Спосіб готування робочих розчинів протеолітичних ферментів викладений у розділі “Лабораторна діагностика ботулізму”.
Приготовлений 4% робочий розчин панкреатину додають до надосадової рідини в співвідношенні 1 см3 панкреатину до 3 см3 надосадовій рідині.
Для активації також можна користатися трипсином; для цього 1% робочий розчин трипсину додають до надосадової рідини до концентрації 0,1% (на 1 см3 надосадовій рідині беруть 0,1 см3 робочого розчину трипсину).
Суміш токсину з ферментом поміщають у термостат при (37±1) ºС на 1 годину, після чого розводять у 3 рази і ставлять розгорнуту РН з культуральною рідиною після активації ферментами для виявлення токсинів типу D і Е, а також, ставлять РН з неактивованою культуральною рідиною, розведеною в 2 рази для виявлення токсинів типів В і С.
Метод постановки розгорнутої реакції нейтралізації
У п'ять пробірок розливають досліджувану надосадову рідину: у першу і другу пробірки – по 1,5 см3 без активації, у третю, четверту і п'яту – по 1,5 см3 рідини після активації. Додають по 0,75 см3 антитоксичні діагностичні сироватки: у першу пробірку – типу В, у третю – типу D і четверту – типу Е (усі сироватки розливають різними піпетками).
Друга і п’ята пробірки є контрольними на присутність токсинів, у них додають по 0,75 см3 фізіологічного розчину.
Суміш витримують 30 хвилин при (37±1) ºС і уводять внутрівенно по 0,75 см3 двом білим мишам з кожної пробірки. Для кожної проби береться окремий шприц.
Результати враховують через добу. При наявності токсинів C.рerfringens гинуть миші, що одержали розчин з контрольної пробірки. Виживають миші, що одержали суміш токсину з гомологічною сироваткою. Так, якщо в досліджуваному матеріалі знаходиться токсин типу В або типу С, виживуть миші, що одержали суміш досліджуваної культури із сироваткою типу В, контрольні миші упадуть. При виявленні токсину типу, що нейтралізується сироваткою, В варто вважати, що в досліджуваному матеріалі міститься C.рerfringens типу В або типу С. Присутність одного з токсинів типів В, С D, Е в досліджуваному матеріалі в сполученні з характерною клінічною картиною дає підставу вважати, що харчова токсикоінфекція викликана штамами одного з зазначених типів C.рerfringens.
Схема розгорнутої реакції нейтралізації
|
№№ пробірок |
Надосадова рідина |
Сироватки антиперфрингенс |
Фізіологічний розчин контроль |
||
|
|
|
типа В |
типа D |
типа Е |
|
|
1 пробірка |
1,5 см3 без активації |
0,75 |
|
|
|
|
2 пробірка |
1,5 см3 без активації |
|
|
|
0,75 |
|
3 пробірка |
1,5 см3 після активації |
|
0,75 |
|
|
|
4 пробірка |
1,5 см3 після активації |
|
|
0,75 |
|
|
5 пробірка |
1,5 см3 посля активації |
|
|
|
0,75 |
Виділення чистої культури
Чисту культуру C.рerfringens виділяють і досліджують у випадку нечіткого результату РН, при наявності в первинних посівах досліджуваного матеріалу (тобто у флаконах) змішаної культури, де, поряд з C.рerfringens, присутня стороння мікрофлора.
Чисту культуру C.рerfringens одержують шляхом пересіву на м'ясні середовища в пробірках окремих характерних колоній (чорні на середовищі Вильсона–Блер, а також оточені зоною гемолізу, чи перламутрового преципітату – на кров'яному або жовтковому агарах). Колонії на щільних середовищах виростають на 2-й день дослідження при вивченні контамінації матеріалу. Колонії, характерні для C.рerfringens, висівають (по 3–5 колоній з посіву кожного зразка досліджуваного матеріалу) на м'ясні середовища в пробірках (див. 2-й день досліджень).
Через 18–20 годин у вирослих посівах визначають методом мікроскопії наявність однорідної культури з морфологією, характерної для C.рerfringens. Пробірки з культурами зберігають при (6±2) ºС і використовують надалі для вивчення чистої культури.
Для виділення чистої культури з секційного матеріалу, що не вивчається на обсеменінність C.рerfringens, варто використовувати культури первинних посівів у флаконах (див. 2-й день дослідження, визначення токсинів). Для виділення окремих колоній використовують середовище Вильсона–Блер, а також кров'яний або жовтковий агари в чашках Петрі, куди стерильно вносять 1 – 2 краплі культури, потім роблять розсів на 2 – 3 чашки шпателем.
Посіви в чашках Петрі вирощують в анаеростатах протягом однієї доби при (37±1) ºС. Окремі колонії, що вирослі пересівають на м'ясне середовище в пробірках.
Для визначення типової приналежності виділених штамів C.рerfringens посівний матеріал із пробірок з м'ясним середовищем пересівають в об’ємі 2 – 3 см3 на одну з рідких поживних в середовищ флаконах.
У вирослій культурі встановлюють присутність специфічних токсинів C.рerfringens методом реакції нейтралізації з типовими антитоксичними діагностичними антиперфрингенс сироватками типів А, В, D, Е (див. 2-й день досліджень).
Критерії діагностики
При наявності клінічних симптомів захворювання результати бактеріологічного дослідження підтверджують діагноз харчовий токсикоінфекції, викликаної C.рerfringens, якщо отримані наступні дані досліджень:
1. Висока контамінація C.рerfringens (більш 106 у ) харчових продуктів, що викликали отруєння.
2. Наявність C.рerfringens типів А, або С в посівах досліджених матеріалів, що підтверджується РН токсинів цих типів на тваринах. Ці показники дають підставу вважати, що причиною харчового отруєння є C.рerfringens типів А або С.
3. Не виключена етіологічна роль C.рerfringens типів В, D, Е в харчових токсикоінфекціях людини, тому виявлення в посівах досліджуваного матеріалу токсинів C.рerfringens кожного з типів В, D, Е свідчить про захворювання відповідної етіології.
4. Виділення з крові хворого штамів C.рerfringens кожного з типів А, В, С, D або Е.
20. МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ РОТАВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ
Гострий початок та короткий перебіг ротавірусного гастроентериту потребує застосування експрес-методів діагностики. Вибір методу в кожному випадку визначається технічним забезпеченням лабораторії та наявністю діагностичних препаратів. Клінічним матеріалом є фекалії або сироватка крові. Наявність і розповсюдження ротавірусів в довкіллі виявляється шляхом дослідження зразків харчових продуктів та води (питна вода, стічна та вода природних та штучних водоймищ), зразків грунту та змивів.
Для дослідження зразків фекалій готують 10% суспензію. При дослідженні зразків об`єктів довкілля і харчових продуктів проводять попередню концентрацію досліджуваного матеріалу.
Виявлення вірусних частин за допомогою електронної і імунноелектронної мікроскопії. Так як в перші 2-3 дні хвороби вміст ротавірусів достатній для виявлення цими методами за характерними морфологічними ознаками та розмірами.
