У випадку загибелі всіх 4-х мишей, тобто тих, котрим був уведений досліджуваний матеріал без сироватки і із сироваткою, варто повторити РН з екстрактами, розведеними в 5, 10, 20 і навіть 100 разів для зменшення неспецифічної токсичності сторонньої мікрофлори, що звичайно присутня в блювотних масах, випорожненнях, органах трупів. При розведенні екстрактів стороння мікрофлора втрачає здатність убивати мишей, а ботулінічні токсини, володіючи звичайно більшою біологічною активністю, будуть викликати загибель мишей навіть при розведенні. Тому в кращому випадку відповідь про наявність токсину в пробі може бути даний на 2 – 3 день, а про його типову належність на 3 – 5 день від початку дослідження.
18.2.2. Виявлення збудників ботулізму
Перший день
Для виявлення збудників ботулізму роблять посів 3 – 5 см3 з попередньо підготовленого матеріалу на рідкі поживні середовища. Для первинних посівів краще використовувати середовище Вільсон-Блера або Кітт-Тароцці. Необхідно, щоб рН був у межах 7,2 – 7,4. Обов'язковим є також наявність у м'ясних середовищах м'ясного або печінкового фаршу. Пробірка або флакон мають бути заповнені поживним середовищем не менш ніж наполовину. Перед посівом середовища нагрівають на киплячій водяній бані протягом 20 хвилин, після чого швидко прохолоджують, додають 0,5% глюкози і роблять посів.
Посіви здійснюють в середовища у великих пробірках або у флаконах ємністю по 100 – 200 см3, залиті шаром вазелінової олії товщиною в . Краще засівати досліджуваний матеріал у великий об’єм середовища (70,0 – 150 см3), щоб культуральної рідини первинного посіву вистачило на всі дослідження (постановка реакції з полівалентною сироваткою і розгорнутої РН, нерідко з двох- або триразовим повторенням). Наступні пересіви досліджуваних проб з первинного посіву в ті ж рідкі поживні середовища можуть не дати токсиноутворення в середовищі, очевидно, через бурхливий ріст сторонньої мікрофлори.
Посів проводять в чотири флакони, один із яких прогрівають після посіву при 60 ºС 15 хвилин. У умовах прогрівання звичайно гинуть аероби і вегетативні форми анаеробів, але зберігаються спори C.вotulinum типу Е, що гинуть при 80 ºС; інший флакон прогрівають при 80 ºС 20 хвилин. Два флакони після посіву не прогрівають. Після цього усі флакони поміщають у термостат: один непрогрітий флакон і флакон, прогрітий при 60 ºС, інкубують при 28 ºС, інший непрогрітий флакон і флакон, прогрітий при 80 ºС, інкубують при 35 ºС. Перші два флакони досліджують на C.вotulinum, типів Е і F, інші два флакони на C. вotulinum типів А, В, С.
Якщо в досліджуваному матеріалі збудники ботулізму знаходяться переважно у вегетативній формі, то ріст у посівах буде, головним чином, у непрогрітих флаконах. У випадку, якщо в матеріалі є спорові форми, ріст буде в прогрітих флаконах і в окремих випадках може відразу привести до виділення чистої культури з такого посіву. Ріст C.вotulinum, характеризується нерідко сильним газоутворенням і іноді протеолізом шматочків печінки або фаршу.
Залишки проб після посіву зберігають у холодильнику до закінчення дослідження.
Через 48 годин після появи росту посіви досліджуються на наявність збудників ботулізму.
В даний час є повідомлення закордонних учених про те, що для виявлення C.вotulinum типу Е в середовище перед посівом варто додавати трипсин до кінцевої концентрації 0,1%.
Оскільки для таких досліджень потрібно трипсин у досить великих кількостях, його можна замінити еквівалентною кількістю панкреатину. Крім того, такі середовища можна брати в пробірках з об’ємом середовища 15 – 20 см3. Трипсин готують у вигляді 1% розчину, стерилізують шляхом фільтрації через азбестові пластини фільтра Зейтца, і додають з розрахунку 1 см3 1% розчину трипсину на 10 см3 середовища у флакони, що будуть інкубуватися при (28±1) ºС. У флакони, що попередньо прогрівалися, трипсин додасться після прогрівання.
Третій день
Через 48 годин від початку росту з усіх флаконів з дотриманням стерильності беруть проби культуральної рідини (по 10 – 15 см3) і піддають їх дослідженню. Попередньо готують мазки, фарбують їх за Грамом і мікроскопують.
З культуральною рідиною ставлять РН з сумішшю ботулінічних сироваток типів А, В, С, Е, F, як це описано для визначення токсинів. При одержанні позитивних результатів РН ставлять з кожною сироваткою окремо.
При виявленні в досліджуваному посіві паличок, типових по морфології для C.вotulinum, а також ботулінічного токсину дають висновок про зараженість досліджуваного матеріалу збудником ботулізму і наявності в ньому ботулотоксину. Виділення чистої культури в такому випадку не є обов'язковим.
Якщо в посівах виявляють мікроби, морфологічно подібні з C.вotulinum, а токсин відсутній, то слід перед постановкою РН провести активацію культуральної рідини панкреатином або трипсином для виявлення ботулінічних токсинів типу Е, непротеолитичних штамів типу В і деяких штамів типу F, а також провести виділення і вивчення чистих культур. Активацію культуральної рідини перед постановкою РН з протиботулінічними сироватками проводять тільки в тому випадку, якщо в середовище перед посівом не був доданий трипсин або панкреатин, як це рекомендовано вище.
Якщо через 48 годин у флаконах не виявлено росту, то необхідно продовжити інкубацію посівів у термостаті, а дослідження провести знову на 4 – 6 – 10 добу. Якщо дослідження, проведені на 10 добу, не дали позитивних результатів по виявленню C.вotulinum і їх токсинів, то видають відповідь про відсутність C.вotulinum і їх токсинів у досліджуваних матеріалах.
Для виділення чистих культур C.вotulinum застосовують прозорий 1% або 1,5% агар із глюкозою, приготовлений на мартенівському бульйоні або бульйоні Хоттингера, розлитий у пробірки діаметром і довжиною 15-. Перед посівом агар розплавляють і прохолоджують до 45 – 50 ºС. Посів на високий стовпчик роблять у такий спосіб: не відламуючи кінця пастеровської піпетки, занурюють її в досліджуваний матеріал (частіше це первинний посів досліджуваного матеріалу) і переносять послідовно з пробірки в пробірку, ретельно перемішуючи, після чого агар перемішується ще раз шляхом перекочування пробірок між двома долонями. Охолоджені пробірки з посівом інкубують при температурі 35 – 37 ºС. На кожен посів варто брати 5 – 8 пробірок стовпчика агару. Якщо в первинній культурі ріст не дуже рясний, при пересіванні на високий стовпчик пастерівську піпетку варто обламати і набрати небагато культури в капіляр, а потім проводити посів, як зазначено вище.
Якщо в первинному посіві відмічено масивний ріст сторонньої мікрофлори і мало типових ботулінічних паличок із спорами, необхідно взяти 5 – 10 см3 культури в пробірку і піддати її прогріванню на водяній бані при 80 ºС 20 хвилин. Після цього культуру треба знову посіяти на високий стовпчик агару.
Через 1 – 2 доби в останніх пробірках з'являються окремі колонії у вигляді грудочок вати, пушинок з ущільненим центром чи правильних дисків, чечевичок. Підозрілі колонії перевивають на рідке або напіврідке поживне середовище у пробірках з 0,5% глюкози під шаром вазелінової олії. Одночасно частину колонії, що залишилася, мікроскопують.
Пересів колоній з пробірок можна робити двома способами:
1. Стовпчик агару проколюють зверху відламаним капіляром пастерівської піпетки і витягають потрібну колонію.
2. Дно пробірки з високим стовпчиком агару злегка підігрівають на полум'ї пальника; під дією пару закипілої рідини агар виштовхується в стерильну чашку Петрі. Підозрілу колонію витягають відламаним капіляром пастерівської піпетки.
Культуру, що виросла з колонії в рідкому середовищі, мікроскопують і перевіряють на наявність токсину за допомогою реакції нейтралізації на мишах.
Посів на чашки. Краплю досліджуваної рідини наносять на поверхню цукрово-кров'яного або печінкового агару, розлитого тонким шаром (приблизно 3–5 мм) у чашці Петрі. Потім краплю шпателем злегка втирають в агар і послідовно переносять шпатель ще на 2 – 3 чашки. Чашки поміщають у микроанаеростат (або GENBOX) кришкою зверху і вирощують при температурі 35 – 37 ºС.
З метою підтримки достатнього вакууму на дно анаеростата ставиться відкрита чашка Петрі з лужним розчином пірогалолу. Через добу колонії C.вotulinum виглядають у виді прозорих росинок димчастого кольору, діаметром 0,1 – , оточені зоною гемолізу.
Через те, що при великому забрудненні досліджуваних проб сторонньою мікрофлорою виникають труднощі у виділенні C. вotulinum, особливо типу Е через те, що чутливість спор цього мікроба до нагрівання не відрізняється від чутливості вегетативних форм деяких мікробів, рекомендується простий метод виділення чистої культури мікроба, заснований на стійкості спор C.вotulinum до 50% спирту.
До 2 см3 культуральної рідини 2 – 3-денні інкубації при 28 ºС, що містить ботулінічний токсин типу Е, додають рівний обсяг етилового спирту-ректифікату. Суміш витримують 1 годину при кімнатній температурі, періодично перемішуючи, а потім з неї роблять висів на 2 – 3 чашки з печінковим агаром, що містить жовток курячого яйця (жовток одного яйця додають у 500 см3 розплавленого й охолодженого до (45-50) ºС агару). Через 48 годин інкубації при 35 ºС в анаеростаті, серед колоній сторонньої мікрофлори, C.вotulinum дають невеликих розмірів колонії, оточені “перловим поясом”. Слід зазначити, що деякі спорогенні анаеробі (C.sporogenes тощо) також мають навколо колоній “перловий пояс”. Ці колонії висівають у пробірки із середовищем типу Тароцци, досліджують після інкубації в термостаті в РН. Особливо цей метод рекомендується для виділення чистої культури C.вotulinum типу Е.
При відсутності в лабораторії анаеростатів або GENBOX для вирощування анаеробів можна використовувати простий чашковий метод, при якому повітря просто виключається з поживного агару. Метод полягає в наступному: засіяний і злегка охолоджений агар наливається в кришку стерильної чашки Петрі, після чого на агар, що майже застиг, міститься друга половина чашки Петрі так, щоб дно її щільне стикалося з поверхнею залитого агару. Краї чашки можна залити парафіном. При цьому методі поверхня скла щільно стикається з агаром по всій його площі, і в шарі агару, що знаходиться між пластинами скла, створюються умови, сприятливі для росту самих строгих анаеробів.
Вирослі колонії розглядають за допомогою лупи або стереоскопічного мікроскопу. Частину колоній використовують для готування мазків для мікроскопії.
З поверхні чашки колонії знімають петлею або пастерівською піпеткою і засівають на пробірки із середовищем типу Тароцци з 0,5% глюкози. Вирослі посіви перевіряють на частоту шляхом мікроскопії і на наявність токсину шляхом постановки РН на мишах.
Метод активації протоксина C. вotulinum
Активацію протоксинів роблять в екстрактах з харчових продуктів, промивних вод шлунка і блювотних мас, а також культуральної рідини посівів, якщо досліджуваний матеріал був засіяний у середовище без трипсину або панкреатину.
Чистий сухий трипсин розчиняють перед вживанням у фізіологічному розчині в концентрації 1:100 (1%-й розчин); цей розчин приймають за вихідний. Для активації беруть даний розчин з розрахунку, щоб в активуємій культуральної рідини його концентрація дорівнювала 0,1%.
Трипсин може бути замінений сухим медичним високоактивним (активність не повинна бути менше 50 одиниць) панкреатином, розчин якого готують у такий спосіб: 4 см3 панкреатину розчиняють у 100 см3 фізіологічного розчину і залишають у холодильнику при (6±2) ºС протягом ночі. Перед вживанням отриману рідину фільтрують через щільний паперовий фільтр, а потім через пластинку фільтра Зейтца, що стерилізує, до одержання прозорої опалесцентної рідини. Готовий розчин панкреатину може зберігатися при (6±2) ºС протягом двох тижнів.
Досліджувану 4 – 5-добову культуру, отриману на рідкому м'ясному або казеїновому середовищі, піддають центрифугуванню або фільтруванню з метою відділення мікробних тіл від культуральної рідини.
Готовий розчин трипсину додають з розрахунку одержання в культуральної рідини концентрації 0,1%, для чого на 1 см3 культуральної рідини беруть 0,1 см3 вихідного 1% розчину трипсину.
Якщо замість трипсину застосовують панкреатин, то культуральну рідину змішують у рівних пропорціях з готовим розчином панкреатину.
Отримані суміші поміщають у термостат при (37±1) ºС на 1 годину. Після закінчення зазначеного терміну в активованій рідині визначають наявність ботулотоксину на білих мишах шляхом постановки РН.
19. СПОРОНОСНІ АНАЕРОБИ – C. рerfringens
19.1. Загальні відомості
В даний час відомо, що C.рerfringens типів А, В, С, D, Е викликають ряд захворювань людини і тварин. Установлено, що причиною харчових токсикоінфекцій у людей можуть бути C.рerfringens типів А і С, з яких краще вивчені харчові отруєння, обумовлені штамами типу А. Роль C.рerfringens, типів В, D, Е в патології людей мало вивчена. Однак, у зв'язку з тим, що вони викликають важкі ентеротоксемії в дрібної і великої худоби, а також у птахів, можна припускати їх етіологічне значення при харчових отруєннях у людей, у випадку вживання в їжу м'яса тварин, контамінованих штамами типів В, С, D, Е, що продукують летальні, некротичні і гемолітичні токсини (β, r, i).
Встановлено, що при харчових токсикоінфекціях, викликуваних C. рerfringens типу А, основну роль у патогенезі захворювання грає ентеротоксин, що продукується in vivo спорулюючими клітками цих мікроорганізмів, що попадають у шлунково-кишковий тракт при інтенсивній контамінації харчових продуктів (106 і більше у см3/г) зазначеними бактеріями.
C. рerfringens типів А, В, С, D, Е – факультативні анаеробі, що ростуть в умовах повного або неповного вакууму (не менш 0,4 атм.), являють собою великі грампозитивні палички, здатні до поліморфізму, нерухомі. Утворюють центральні або субтерминальні спори, які у деяких штамів типів А і С можуть витримувати кип'ятіння від 1 до 6 годин. Оптимальна температура для культивування C. рerfringens, знаходиться в межах 37 – 45 ºС, однак активний синтез токсинів ά, β, έ, і) відбувається при температурі 37 ºС. Ріст культури на рідких поживних середовищах супроводжується сильним газоутворенням. На щільних поживних середовищах C.рerfringens утворює різні форми (S, M, R) безбарвних колоній, що на агарі з кров'ю звичайно оточені зоною гемолізу, на агарі з жовтком – зоною перламутрового преципітату різної інтенсивності. На середовищі Вильсона–Блер колонії що вирослі, мають інтенсивний чорний колір.
