Будучи факультативними аеробами, стафілококи добре ростуть на різних субстратах. Розмножуються вони однаково добре як у продуктах, багатих вуглеводами, так і в продуктах, багатих білками, не змінюючи при цьому зовнішнього вигляду, кольору і смаку харчового продукту. Пов’язувати стафілококові інтоксикації з певним видом харчових продуктів у даний час не представляється можливим. Практично варто вважати, що будь-який харчовий продукт може бути причиною цих захворювань, або то молочні, м'ясні продукти, кондитерські вироби, продукти рослинного походження або різні консервовані продукти.

Харчові продукти, що викликають стафілококові інтоксикації, звичайно бувають значно забруднені золотистими (коагулазопозитивними) стафілококами. У грамі такої їжі виявляються сотні тисяч, мільйони стафілококів.

Стафілококи стійкі до дії фізичних і хімічних факторів: добре витримують висушування і дію прямого сонячного світла. У рідкому середовищі стафілококи переносять нагрівання при температурі 70 ºС протягом години, а при температурі 80 ºС протягом 10 хв.

Температурний оптимум 37 ºС, температурні межі розмноження відзначаються в широкій зоні від 6,6 ºС до 45 ºС .

Стафілококи дуже стійкі до хлористого натрію, що знаходиться в продуктах, при концентрації NaCl рівної 7-10% ще спостерігається їх розмноження.

Цукор не перешкоджає розмноженню стафілококів, і лише концентрація його більш 60% є затримуючим чинником їх росту.

Продуктом життєдіяльності S.aureus є ентеротоксин, особливістю якого, у порівнянні із бутулінічним, є його висока терморезистентність. Ентеротоксин витримує автоклавування при 120 ºС протягом 20 хв. Зниження терморезистентності ентеротоксину пов'язане з рН середовища. Так, при рН 4,5 нагрівання на киплячій бані протягом 40 хв. знижує активність ентеротоксина в 10 разів, а при рН 3,0 ентеротоксин цілком руйнується.

Встановлено, що фільтрати культур S.aureus, що викликали харчові інтоксикації, являють собою комплекс різних білкових речовин, специфічних поліпептидів, що містять антигенно різні типи ентеротоксинів.

В даний час відомо вже 6 типів стафілококових ентеротоксинів, що позначені буквами латинського алфавіту А, В, С, D, E, F.

Однак, техніка одержання очищених ентеротоксинів, необхідних для виготовлення антиентеротоксичних сироваток, пов'язана з великими методичними труднощами і дотепер ці сироватки є тільки в деяких високоспеціалізованих лабораторіях.

16.2. Бактеріологічні дослідження

Другий день

1. Переглядають посіви на чашках з жовточно-сольовим агаром (ЖСА) або середовищем Байрд-Паркер і з окремих типових колоній готують препарати, фарбують їх за Грамом і мікроскопують. Колонії S.aureus на ЖСА мають форму правильних дисків від 2 до у діаметрі, з рівними краями і помірно опуклою поверхнею оточені зоною лецитиназної активності. Колонії не прозорі і пофарбовані в колір пігменту, утвореного мікробами (від білого до оранжево-жовтого кольору). На середовищі Байрд-Паркер колонії S.aureus круглі, випуклі, середнього розміру, чорного кольору блискучі із зоною лецитиназної активності

При виявленні грампозитивних коків для подальшого вивчення роблять відсів чистих культур на скошений агар, інкубують при (37±1) ºС 18 – 24 години.

2. При відсутності росту на ЖСА, підозрілих на S.aureus колоній, роблять висів із середовищ збагачення на сектори щільних середовищ. Із сольових бульйонів проводять висів на МПА з глюкозою або з кров'ю, з цукрових бульйонів на ЖСА.

Третій день

1. Проводять підрахунок колоній стафілококів, що виросли при первинному посіві продукту, на ЖСА (або середовищі Байд-Паркер), і роблять перерахунок їх числа на 1 г/см3. Кількісний облік стафілококів, що виросли при посіві матеріалу від хворих, не роблять.

2. Перевіряють у мазках, пофарбованих за Грамом, чистоту культур на скошеному агарі і визначають їх патогенність у реакції плазмокоагуляції.

Реакція плазмокоагуляції

Для постановки реакції плазмокоагуляції (РПК) використовують комерційний препарат, який представляє собою ліофілізовану під вакуумом плазму кролячу цитратну в скляній ампулі. Вміст ампули розчинити в 1 або 2 см3 стерильного 0,9% розчину хлориду натрію і розвести із розрахунку 1:5 тим же розчином.

По 0,5 см3 плазми, розведеної 1:5, внести в стерильні пробірки з пробками і по одній петлі досліджуваної добової агарової культури, ретельно розтерти у плазмі. Одну пробірку з плазмою залишають незасіяною, як контроль. Пробірки поміщають у термостат при (37±1) ºС. Облік результатів проводять згідно інструкції до препарату через 3 – 18 – 24 години.

Ступінь коагулювання плазми відзначають знаками «+».

РПК вважають позитивною, починаючи з 2+ до 4+. При реакції на 2+ утвориться невеликий компактний згусток, у той час як у реакції на 1+ згусток дифузійний. З метою прискорення дослідження для РПК замість добових агарових культур можна застосовувати 2–3-годинні бульйонні культури, додаючи їх по 2 краплі до 0,5 см3 розведеної плазми. Облік результатів коагуляції плазми в даному випадку проводять у терміни від 30 хвилин до 2 – 4 годин.

При відсутності коагулазопозитивних стафілококів при первинному посіві на щільні середовища, вивчають колонії, виділені із середовищ збагачення, як описано в розділі “Третій день”.

Для оцінки результатів дослідження на S.aureus при харчових отруєннях вказується кількісне обсіменіння ними харчових продуктів, що у цих випадках виражається в сотнях тисяч і більш на продукту.

Кількісний облік коагулазопозитивних стафілококів у харчових продуктах служить непрямим показником наявності в них ентеротоксинів. Цей показник варто використовувати враховуючи, у кожному конкретному випадку, характер харчового продукту, технологію його приготування, спосіб і час зберігання.

Орієнтовними критеріями можуть бути:

  • рівень контамінації стафілококами підозрюваного продукту ?? 105 КУО/см3;
  • рівень контамінації матеріалу від потерпілих (блювотні маси, промивні води шлунку, випорожнення) ?? 103 КУО/см3.

Належність виділених стафілококів до S.aureus.

Ідентичність штамів стафілококів, ізольованих з матеріалу від потерпілих, з підозрюваних продуктів та від джерела (хворий, носій).

Примітка: Такі кількісні критерії є провідними для бактеріологічної діагностики харчових токсикоінфекцій і не є обов’язковими в разі встановлення етіології харчової інтоксикації.

В даний час при стафілококових інтоксикаціях серологічні реакції з кров'ю потерпілих не ставлять.

16.3. Фаготипування S.aureus

При епідеміологічному вивченні стафілококових інтоксикацій застосовують метод фаготипування стафілококів. Типуванню підлягають усі S.aureus, виділені з інкримінованого продукту, від потерпілих, зі змивів з інвентарю, устаткування та ін. Для цих цілей використовують міжнародний набір типових бактеріофагів. Дослідження проводять за методикою, що наведена в Інструкції до набору.

Біологічні дослідження

Біологічні дослідження проводять:

  • для вивчення здатності виділених S.aureus утворювати ентеротоксин на поживних середовищах;
  • для виявлення наявності стафілококового ентеротоксина в інкримінованому продукті. В якості експериментальних тварин можуть бути використані кошенята (1,5 – 2-місячні) і дорослі кішки.

Біологічна проба на кошенятах. Досліджуваний продукт або п’ятидобову молочну культуру виділеного стафілокока (15 – 20 см3) згодовують кошенятам натще. Якщо кошенята не їдять даний продукт, варто приготувати суспензію продукту в дистильованій воді (1:1), добре гомогенізувати і споїти по 15 – 20 см3 кожному кошеняті за допомогою піпетки або ложки. У досліді повинно бути 2 – 3 кошенята. Позитивною реакцією вважають блювоту, що наступила через 30 – 60 хвилин, іноді спостерігаються понос і загальна прострація. Блювота, що з'являється через 5 – 10 хвилин, неспецифічна. Спостереження за кошенятами ведуть протягом 4 – 5 годин. Якщо за цей період кошенята не реагують, біологічна проба вважається негативною.

Біологічна проба на кішках. Ентеротоксичність визначають шляхом внутрішньовенного введення матеріалу кішкам. Цей метод внутрішньовенного введення матеріалу дорослим кішкам досить чуттєвий. Недоліком методу є обмеженість його застосування для виявлення ентеротоксина безпосередньо в продуктах. Для виявлення ентеротоксичності культур користуються 0,75% агаром на телячому бульйоні або бульйоні Хоттінгера з 0,25% глюкози рН 7,4. Чашки, засіяні культурами стафілококів, поміщають в ексикатор з 20% вуглекислотою і інкубують 48 годин при 37 ºС.

Щоб одержати в ексикаторі 20% вуглекислоти, насипають на дно останнього двовуглекислу соду з розрахунку соди на кожен літр об’єму ексикатора, завантажують його чашками і, трошки відкривши кришку, наливають піпеткою Мору 10% соляну кислоту безпосередньо на соду (на соди – 8-9 мл кислоти). Після додавання кислоти кришку ексикатора швидко накривають і притирають.

Після інкубації чашки виймають і на поверхню агару наливають 10 см3 фізіологічного розчину, агар подрібнюють до рівномірної кашкоподібної консистенції і залишають при кімнатній температурі на 2 години. Екстракт центрифугують до одержання прозорого шару, що відсмоктують, прогрівають у киплячій водяній бані протягом 30 хв. і вводять кішкам у кількості 0,5 см3 на ваги тіла у вену вуха або в стегнову вену.

Наявність блювоти і поносу або тільки блювоти, що наступила в терміни від 30 хвилин до 3 годин вказує на присутність ентеротоксина. Кожну кішку можна використовувати для цих цілей 3 – 4 рази. При одержанні негативних результатів у кішки, що раніше була використана для аналогічних визначень, необхідна перевірка на кішці, що не була в досліді.

За допомогою методу внутрішньовенного введення кішкам вирішувати питання про наявність ентеротоксина в харчовому продукті потрібно з великою обережністю. З продукту, досліджуваного на наявність ентеротоксина, готують суспензію в стерильному фізіологічному розчині таким чином, щоб при наступному центрифугуванні одержати достатню кількість надосадової рідини для постановки біологічної проби. Як контроль необхідно одержати негативний результат у кішки, призначеної для досліду, при введенні надосадової рідини, отриманої з доброякісного тотожного продукту, підготовленого тим же способом, що і досліджуваний зразок.

17. БАКТЕРІЇ РОДУ ENTEROCOCCUS

17.1. Загальні положення

Ентерококи відносяться до роду Enterocococcus, 17 групи за Bergey, 1994 “Грамнегативні коки” Вони є мешканцями кишечнику людини, і розглядаються як умовно-патогенні мікроорганізми, що має санітарно-показове значення. У середині роду виділено 11 видів, які викликають інфекційні процеси частіше всього в асоціаціях з кишковою паличкою, протеєм, S.aureus. Найчастіше ураження людей викликають Е. faecalis, Е. faecium, Е. durans.

Для ентерококів характерні такі основні властивості.

Ентерококи досить повільно ростуть на звичайних поживних, середовищах тому для більш інтенсивного росту в середовища додають вуглеводи (глюкозу, лактозу) багатоатомний спирт – манітол, дріжджові препарати (аутолізати, діалізати, екстракти), амінокислоти (аргінін, аланін і ін.), вітаміни (рибофлавін, нікотинова кислота й ін.)

Ріст ентерококів досягає максимуму через 36–48 годин при 37 ºС. Температурні межі росту коливаються від 10 ºС до 50 ºС у залежності від виду ентерококів.

На щільних поживних середовищах ентерококи утворюють дрібні округлі колонії. При рості в рідких середовищах вони спричиняють дифузне помутніння й утворення аморфного осаду.

Ентерококи стійкі до багатьох барвників (кристалвіолету, фуксину та ін.) і антибіотиків (пеніциліну, стрептоміцину, поліміксину тощо).

У мазках з рідких середовищ ентерококи розташовуються у вигляді коротких і довгих ланцюжків, у щільних – у вигляді диплококів або скупчень коків. Фарбуються за Грамом позитивно. Спор і капсул не утворюють. Як правило, нерухомі, але описані і рухливі варіанти з 1 – 4 джгутиками. Різко поліморфні. Поліморфізм особливо виражений у культур, виділених з харчових продуктів.

Серологічно ентерококи являють собою досить однорідну групу мікроорганізмів, що володіє полісахаридним антигеном «Д» по Ленсфільд. У штамів Е. faecalis і його варіантів відзначена наявність видового антигену, що по своїй хімічній природі є полісахаридам.

Для всієї групи ентерококів характерна стійкість до 40% жовчі, 6,5% хлористого натрію і високого рН (9,6 – 10,2). Усі вони не ферментують рафінозу і не розкладають перекис водню (Н2О2), тому що не виробляють фермент – каталазу.

У свежовиділеніих штамів ентерококів відзначаються протеолітичні властивості. Саме ті ентерококи, що володіють протеолітичними ферментами, можуть зумовити харчове отруєння при вмісті 106 і більше КУО в 1 г/см3 продукту.

Ентерококи є облігатними представниками нормальної мікрофлори кишечнику людини і теплокровних тварин, у зв'язку з чим дуже широко поширені в довкіллі, у тому числі й у різних харчових продуктах, але особливо часто їх виявляють у молочних продуктах. Органолептика продуктів залежить від виду ентерокока, який забруднює продукт. Так, штами Е. faecium не змінюють органолептику м'ясних продуктів, а молоко згортають і додають йому приємний смак кисломолочного продукту. Штами ж ентерококів, що можуть викликати харчові отруєння додають продуктам неприємний гіркий смак і ослизнення, але органолептичні зміни в продуктах настають, коли в них міститься більш ніж 106 клітин ентерококів у 1 грамі.

При лабораторній діагностиці ентерококових харчових отруєнь дослідженню варто піддавати продукти, запідозрені як причина захворювання і випорожнення потерпілих.

17.2. Бактеріологічні дослідження

Третій день

Через 48 годин посіви переглядають. Типові колонії ентерококів мають округлу форму, рівні краї, блискучу поверхню, діаметр 1,5 – і бордове фарбування на світло-рожевому тлі середовища Ентерококагар або сіре з зоною протеолізу на середовищі . Підраховують усі типові колонії і число їх перераховують на 1 г/см3 продукту. 3 – 5 колоній відсівають на скошений агар для подальшої ідентифікації. На скошеному агарі посіви культивують при (37±1) ºС протягом 24 годин.