Для підтвердження приналежності виділених лістерій до виду L. monocytogenes визначають здатність до ферментації рамнози, ксилози, наявність лецитиназної і β-гемолитичної активності і проводять постановку CAMP-теста. Диференційні ознаки видів, роду Listeria зазначені в табл. 28.

Для видової диференціації виділених культур лістерій рекомендується використовувати біохімічні тест-системи API Listeria фірми “BioMerieux”. При їх застосуванні варто керуватися рекомендаціями виробника.

САМП-тест ставлять для диференціації L. monocytogenes від інших видів лістерій, що володіють β-гемолітичною активністю. Для проведення тесту 2-3-добові культури гемолітичних штамів S. aureus і R. equi засівають на кров'яний агар з еритроцитами барана двома рівнобіжними штрихами на відстані 5,0 – , як показано на мал. 1.

Між вертикальними штрихами S. aureus і R. equi засівають рівнобіжними штрихами досліджувані культури лістерій на відстані друг від друга не менш і від вертикальних штрихів – . У якості контролю використовують тест-штами L. monocytogenes і L. ivanovii. Інкубують 24 години при (37±1) ºС. Визначають форму і розміри зон гемолізу біля вертикальних штрихів росту стафілокока і родокока.

Listeria monocytogenes дає розширення зони гемолізу біля штриха S. aureus (позитивний САМП-тест) і має відсутність змін зони гемолізу поруч зі штрихом R. equi (негативний САМП-тест).

Визначення лецитиназної активності. Дно двох чашок Петрі із середовищем № 1 (поживне середовище для культивування та підрахунку аеробних бактерій), що містять: 1 чашка – жовток курячого яйця і активоване вугілля, 2 чашка – жовток курячого яйця без активованого вугілля – ділять на кілька секторів або квадратів. Досліджувані культури і контрольні штами лістерій пересівають паралельно короткими штрихами на відповідні сектори чашок, з вугіллям і без нього. Інкубують 48 год. при (37±1) ºС. Чашки переглядають у минаючому світлі і визначають наявність активності в присутності і у відсутності активованого вугілля, порівнюючи з контрольними висівами музейних штамів. Listeria ivanovii дає щільну зону помутніння шириною 3- незалежно від присутності активованого вугілля. Listeria monocytogenes дає аналогічну зону помутніння в присутності активованого вугілля і не дає при відсутності вугілля. Інші види лістерій не дають зони помутніння.

Імунофлюоресценція – при фарбуванні лістерійними люмінесціюючими антитілами відбувається специфічне світіння типових клітин на 3-4+.

Біологічна проба – ставиться на білих мишах, підшкірним або внутрішньом'язовим зараженням в дозі 0,3-1 см3 добової зависі культури (105-.к.). Лістерії викликають загибель тварин на 3-6 добу. При розтині виявлять численні некротичні вогнища у печінці, селезінці, нирках та міокарді.

Керато-кон'юнктивальна проба- проводиться шляхом нанесення на слизову оболонку ока морської свинки 2-3 крапель добової бульйонної культури лістерій. Через 18-24 години з'являється набряк віка, гіперемія, сльозотеча і через 36-72 години з ока виділяється гнійний ексудат.

Четвертий – шостий день

Облік результатів посівів за кожним тестом ідентифікації культури окремо (таблиця 28).

Таблиця 28

Характеристика бактерій роду Listeria

Ознака

L.mono-cytogenes

L.ivano-vii

L.see-ligeri

L.inno-cua

L.grayi

L.wel-shimeri

Ферментація:

маніту

-

-

-

+

-

ксилози

-

+

+

-

-

+

рамнози

+

-

-

+/-

+/-

+/-

β-гемоліз

+

+

+

-

-

-

CAMP-тест збільшення гемолізу біля штриха:

R. equi

-

+

-

-

-

-

Staphylococcus aureus

+

-

+

-

-

-

Лецитиназна активність:

на середовищі з активованим вугіллям

+

+

-

-

-

-

на середовищі без вугілля

--

+

-

-

-

-

При негативних результатах перших висівів з середовищ збагачення, дослідження повторюються з наступних висівів, які повторюються через 7 – 10 діб протягом 3 тижнів.

15. СПОРОНОСНІ АЕРОБИ – B. cereus

15.1. Загальні положення

B.сereus ґрунтовий мікроорганізм надзвичайно широко розповсюджений у довкіллі – воді, повітрі і пилу приміщень, на устаткуванні й апаратурі підприємств харчової промисловості і громадського харчування. Завдяки широкому поширенню в довкіллі B.сereus часто виявляється в продуктах харчування, де при сприятливих умовах розмножується до кількостей 106-107 у і може викликати харчові отруєння.

Низька вимогливість до умов, необхідних для росту, приводить до того, що B.сеrеus може розмножуватися на будь-якому продукті харчування і внаслідок цього практично будь-який продукт при його масивному обсіменінні даним мікроорганізмом може привести до виникнення захворювання. У зв'язку з B.сеrеus описані отруєння, викликані м'ясними, рибними, рослинними і молочними продуктами, кондитерськими виробами.

За сучасною класифікацією B.сеrеus віднесений до роду Bacillus, групи 18 “Грампозитивні палички і коки, що утворюють ендоспори”, яка поєднує 25 видів.

У мазках з поверхні скошеного агару, пофарбованих за Грамом, B.cereus має вид великих, грампозитивних паличок зі злегка закругленими кінцями, що лежать у вигляді ланцюжків чи штахетоподібних скупчень, рідше – окремо один від одного. У висячій краплі рухливі, однак, можуть зустрічатися штами зі слабко вираженою рухливістю (близько 15%) і навіть зовсім позбавлені рухливості (менш 0,5%). На поверхні МПА утворюють великі розпластані колонії білого кольору зі злегка порізаними краями. На середовищах з жовтком колонії оточені широкою зоною глибокого рівномірного білого-матового коагуляту (позитивна реакція на лецитиназу). На поліміксинових середовищах із ТТХ (2,3,5 трифенилтетразолій хлорид) колонії B.cereus зернисті, матові, яскраво рубінового кольору на тлі зони білого коагуляту. На кров'яному агарі колонії B.cereus сіруватого забарвлення, зернисті у відбитому світлі, з перламутровим відливом у минаючому світлі, оточені зоною гемолізу різної інтенсивності. На стовпчику скошеного агару B.cereus дає суцільний білий ріст, іноді борошнистого виду. Ріст цього мікроорганізму на рідких поживних середовищах супроводжується помутнінням бульйону, утворенням пластівчастого осаду білого кольору (25-30% штамів) і ніжної білої плівки на поверхні середовища. Усі штами B.сеrеus згортають молоко, частково пептонізуючи його на 6-10 добу. Близько 85% штамів розріджують желатин протягом 1 – 4 діб. Усі без винятку штами B.cereus дають позитивну реакцію на лецитиназу й ацетилметилкарбінол, розщеплюють до кислоти глюкозу і мальтозу, а частина штамів – також сахарозу, гліцерин, декстрин, лактозу, галактозу, інулін і дульцит.

Оптимум росту для B.cereus 30 ºС однак, спори його можуть проростати в широкому інтервалі температур – від (3-5) до 70 ºС і давати ріст при (6-55) ºС (близько 4%), а при температурі (12-39) ºС досить інтенсивне зростання дають усі штами даного мікроорганізму. B.сеrеus здатний давати ріст у широкому інтервалі рН від 4 до 12,5 і найбільше інтенсивно від 7 до 9,5. Досить стійкий він до дії повареної солі, цукру, коптильних препаратів. Поварена сіль затримує розмноження цього мікроорганізму лише при 10-15% змісті.

B.cereus легко і швидко утворює спори. Вміст спор вже в 2-добовій культурі складає до 50% від загального числа клітин даного мікроорганізму. При цьому спори B.cereus мають досить високу температурну стійкість і можуть виживати не тільки при звичайних методах технологічної обробки їжі (варіння, обсмажування, кип'ятіння), але і при стерилізації молока і консервів.

Критеріями діагностики захворювань, викликаних B.cereus, є: виявлення B.cereus у підозрюваному продукті харчування в кількості більш ніж 105 у ; виявлення B.сereus у випорожненнях, блювотних масах або промивних водах шлунку в кількості 102-103 у 1 г/см3; виявлення B.cereus у випорожненнях більшості потерпілих при розслідуванні отруєння; виявлення B.cereus при спорадичних захворюваннях у випорожненнях потерпілого тільки в гострий період захворювання з наступним зникненням цього мікроорганізму з кишкового вмісту до моменту видужання.

15.2. Бактеріологічні дослідження

Другий день

Вивчають морфологію колоній, що виросли, мікроскопію мазків, пофарбованих за Грамом, і підраховують типові колонії. Штами B.cereus на середовищі Никодемуса утворюють великі білі розпластані колонії зі злегка порізаними краями, оточені широкою зоною білого рівномірного матового коагулянту або подвійною зоною – коагулянт і просвітління. На сольовому поліміксиновому агарі з 2,3,5-ТТХ вони утворюють яскраво рубінові колонії на тлі широкої зони глибокого рівномірного білого коагуляту; колонії з перших годин росту – округлі, опуклі, надалі (24–48 годин) розпластані на поверхні агару з порізаними краями. На кров’яному агарі колонії розпластані, зернисті, з широкою зону гемолізу.

Для визначення B.cereus у досліджуваному об'єкті, кількість типових колоній, що вирослі на чашках, множать на відповідне розведення і виражають у перерахунку на 1 г/см3 досліджуваного об'єкта.

Пересівають 3 – 5 колоній на скошений агар з наступною інкубацією 18 – 24 години при температурі (30 – 37) ºС.

Третій день

Вивчають характер росту на скошеному агарі, морфологію культур, що виросли, у пофарбованих за Грамом препаратах і перевіряють чистоту культури. Мікроскопія висячої або роздавленої краплі для встановлення рухливості виділеної культури. B.сereus, у відмінності від B.аnthracis, рухливі. Посів на диференційний ряд, що включає: арабінозу, ксилозу, крохмаль, маніт. Інкубація протягом 18-24 годин при температурі (30-37) ºС. Пересів на глюкозо-пептонний бульйон (інкубація 48 годин при температурі (30–37) ºС для наступної постановки реакції на ацетилметилкарбінол.

Четвертий день

Ідентифікація виділених культур по диференційному ряду і кров'яному агару.

П'ятий день

Постановка реакції на ацтилметилкарбінол. Позитивна реакція відзначається у вигляді рожевого забарвлення через 2-24 години інкубації при (37±1) ºС. Остаточний облік реакції через 24 години.

Характерним для B. cereus є гемолітична активність, позитивна реакція на лецитиназу й ацтилметилкарбінол, рухливість і відсутність здатності ферментувати маніт (таблиця 29).

Таблиця 29

Диференціація B. cereus з B. anthracis та іншими аеробними споровими сапрофітами

Назва

Диференційні тести

Гемолітична активність

Лецитиназна активність

Ацетилметил-карбінол

Рухливість

Арабіноза

Ксилоза

Крохмаль

Маніт

B. cereus

+

+

+

+

-

-

+

-

B. antracis

+

-

-

-

+

B. mycoides

+

+

+

+

-

-

+

B. megaterium

+

+

±

±

+

±

B. subtilis

+

+

+

+

+

+

+

B. pumilis

+

+

+

+

+

-

16. БАКТЕРІЇ РОДУ STAPHYLOCOCCUS

16.1. Загальні положення

Стафілококи належать до широко розповсюджених в природі мікроорганізмів. За класифікацією Берджи вони відносяться до родини Micrococcaceae роду Staphylococcus, що включає 27 видів, з них декілька патогенних для людей: S.aureus, S. epidermidis, S.saprophyticus.

Стафілококи – грампозитивні мікроорганізми сферичної форми, що діляться більше ніж у двох площинах, мають фермент каталазу, що відрізняє їх від мікроорганізмів інших родів родини Micrococcaceae, які не мають цього ферменту.

Здатність деяких стафілококів коагулювати цитратну плазму крові під впливом ферменту коагулази визначає їх патогенність.

Позитивна реакція плазмокоагуляції є показником патогенності стафілококів і, одночасно, є показником потенційної їх ентеротоксичності. Роль ентеротоксигенних стафілококів у етіології харчових стафілококових токсикозів загальновизнана і в даний час не викликає сумнівів. При цьому інвазія життєздатних бактерій не обов’язкова, хоча може передумовити або супроводжувати інтоксикацію. Така особливість пояснює можливу відсутність живих стафілококів інкримінованому продукті і зумовлює негативний результат бактеріологічного дослідження.